Laboratório de micologia

 

Métodos de identificação dos hospedeiros

Na identificação dos hospedeiros são analisados tanto caracteres vegetativos quanto reprodutivos como frutos ou sementes. Deverá ser utilizada bibliografia especializada além da indispensável comparação com material de herbário.

Isolamento de amostras

Após a identificação Botânica - no caso de vegetais com suspeita de doença - o material deve conter uma parte com sintomas e uma parte sadia. A área de intersecção, geralmente com sintomas cloróticos, deve ser escolhida no caso de plantação direta dos tecidos. Deve-se sempre evitar partes muito atacadas ou apodrecidas por poder conter fungos secundários. Para fungos não patogênicos os métodos podem sofrer algumas variações, no entanto, seguem de forma geral a mesma orientação dos utilizados para fungos fitopatogênicos.

A plantação direta dos tecido consiste em remover para o meio de cultura pequenos fragmentos dos tecidos infeccionados, depois de desinfestada sua superfície.

A plantação direta dos tecidos se faz, geralmente, quando não existem esporos (frutificações) do organismo a isolar, devendo-se dar preferência aos tecidos das margens da zona invadida pelo patógeno. Sempre o isolamento deve ser feito em condições assépticas, procurando-se locais sem correntes de ar ou pela utilização de câmara de fluxo laminar e com instrumentos esterilizados.

Quando existem frutificações do fungo, o que pode ser conseguido submetendo-se o material ao processo de câmara úmida por 2 a 4 dias, o isolamento poderá ser realizado com um agulha histológica flambada, removendo-se alguns esporos para o interior do meio de cultura. Este procedimento deve ser efetuado sob lupa, tocando-se delicadamente apenas a superfície da frutificação do fungo, na tentativa de se evitar a contaminação com outros microrganismos indesejáveis.

O isolamento indireto é feito quando material está muito contaminado por organismos secundários e é difícil a sua desinfestação superficial, ou quando se pretende fazer uma separação preliminar do patógeno antes de isolá-lo. Este tipo de procedimento é muito utilizado para o isolamento de Phytophthora e Phytium, que são patógenos que causam problemas em raízes, local de ocorrência de vários outros microrganismos. Para isto, inocula-se maçãs ácidas (de casca amarela), fazendo se incisões em forma de triângulo com uma profundidade de cerca de 2 cm e colocando se pequena quantidade do material contaminado (raízes ou terra) no interior da maçã, recolocando-se a parte da maçã retirada. Após alguns dias a maçã começa a apodrecer devido ao crescimento do fungo quando se procede o isolamento por plantação direta do tecido da maça em meio de cultura. Outro tipo de isolamento de fungos zoosporicos pode ser realizado pela colocaçao das áreas suspeitas de um lado de um recipiente com água destilada estéril e de outro lado algumas sementes de sorgo, fios de cabelo, casca de camarão etc., dependendo do fungo a ser isolado, mantendo-se a aeração do sistema para produção de zoósporos. Os zoósporos produzidos no material infectado nadam até a semente de sorgo, por exemplo, permitindo o seu isolamento.

Os meios de cultura mais comumente utilizados para o isolamento e manutenção de fungos fitopatogênicos ou outros são os ágar água (AA) e ágar batata (AB).

O meio AA é um meio pobre em nutrientes, o que dificulta o crescimento de competidores e é principalmente utilizado nas primeiras fases do isolamento dos fungos. Alguns fungos mais exigentes em nutrientes não são capazes de crescer neste meio, por outro lado, quando há contaminação por bactéria, este meio pode permitir a separação do fungo e da bactéria, já que o fungo tem, normalmente, um crescimento mais rápido. Em alguns casos pode-se adicionar antibióticos aos meios de cultura para evitar o crescimento de bactérias ou mesmo de outros fungos.

O meio AB, é mais rico em nutrientes e pode ser utilizado para isolamento e manutenção de culturas de fungos. Quando há contaminação por bactérias ele pode ser acidulado até ao redor de pH 4,5 – 5,0 que pode evitar o crescimento das mesmas. Pode-se também evitar o crescimento de bactérias adicionando antibióticos como Claforan ao meio (25mg/L). Portanto, os meios mais frequentemente utilizados no laboratório serão AA ou AB.
No caso de fungos ecologicamente obrigados, como as ferrugens, o isolamento requer tecnicas sofisticadas para seu isolamento. Devido a isso, o material deve ser identificado e acondicionado apenas no herbário.

Métodos de preservação

Castellani ou água destilada
É um processo extremamente simples que consiste na inclusão em pequenos frascos de vidro (tipo penicilina), contendo água destilada esterilizada, de pequena porção do meio de cultura (aproximadamente 5mm de diâmetro), contendo o fungo que se deseja preservar.

Repicagens periódicas (subcultura)
Consiste, essencialmente, na repicagem dos fungos, cultivados em tubos de ensaio contendo meios adequados, 3 a 4 vezes ao ano, ou seja, a cada 3 ou 4 meses, de modo que o fungo seja transferido para outro tubo antes que o substrato esteja completamente consumido. Quanto conservados a baixa temperatura muitas vezes é possível realizar repicagem em períodos maiores.

Liofilização
Consiste na desidratação (sublimação) das células ou esporos por congelamento e a vácuo com posterior armazenamento também sob vácuo e em condições de refrigeração. Usualmente, os esporos ou células são suspensos em um colóide que pode ser leite desnatado (10 – 20%); hemosoro bovino; solução a 1% de lactose, glicose ou sacarose ou sacarose e peptona a 5%. Podem ser usadas também misturas de vários desses componentes como 10% de leite desnatado acrescido de 10% de inositol. Uma prática comum no processo de liofilização é colocar-se, junto com a suspensão de esporos, no interior das ampolas a serem liofilizadas, pequenas tiras de papel absorvente esterilizado que absorvem parte da suspensão durante o processo de desidratação. As ampolas, contendo as suspensões de esporos são mantidas em freezer até sua solidificação (congelaento), depois são adaptadas ao liofilizador (uma bomba de vácuo acoplada a um sistema coletor de vapores da água - dessecadores). Após a liofilização as ampolas são guardadas a temperatura ambiente ou em refrigerador a 4o – 6o C.

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